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沙发
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发表于 2019-3-1 23:28:40
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什么障碍呢?我们继续用射击做比方:能得分的目标靶子通常是唯一的,而目标外的“别人家的靶子”可就是千千万万各有不同了。想象一下,如果随便撒一把CRISPR/Cas9去编辑十万个细胞的基因,假设每个都脱靶,且这些脱靶都是随机产生的,那么这十万个细胞最多就会有十万种脱靶,每一种脱靶形式只占了所有样本的十万分之一,这种微乎其微的异常几乎不可能被检测出来。
因此,脱靶检测需要依赖所谓的“单细胞测序”,通俗来说,就是实验组和对照组都只有一个细胞。这样的对比当然就能很容易发现差别,但是很显然,一个细胞那一丁点DNA是根本不够拿来检测的。为了解决这个矛盾,就要用到“体外扩增”技术,把那一丁点DNA样本复制成千上万份,直到数量满足检测所需为止。
但是,人类发明的任何体外扩增体系都是不完美的,无法做到100%精确拷贝最初的DNA样本,每一次复制都会带入一丁点错误。就像复印文稿总比原稿品质差一些一样,经过千万次复制再复制,就足以让这份DNA样本变得面目全非,干扰检测结果。
多次下载图片再重新上传也会导致图片文件出现明显的“劣化”。
这一切引入的“噪音”甚至比脱靶信号本身还要高出好几个数量级,这宛如是在汪洋大海中寻找一滴水一般。
一举三得该如何实现?
找到这滴水的唯一办法就是让大海(各种干扰因素)消失。左二伟博士与导师杨辉还真的想到了一种绝妙的方式,同时解决了这三个问题。
为了避免个体差异,我们又需要找到两个基因一模一样的细胞,为了凸显脱靶的信号,我们又需要用到“单细胞测序”,然后我们还不能用体外扩增来复制这两个细胞的DNA,却又需要很大量的DNA样本来做测序分析。
首先最容易解决的就是找两个基因完全一模一样的细胞。我们知道,多数动物都是从一个受精卵发育而来的,这个受精卵一分为二,二分为四……等等,在它一分为二的时候,我们称之为“二细胞期胚胎”阶段,不就是两个现成的基因一模一样的细胞吗?
只要向其中一个注射基因编辑工具,另一个就是世界上最佳的对照。
其次,一个细胞的DNA不是不够检测么?没关系,注射完毕后我们直接把这个二细胞胚胎植入母鼠的子宫当中,让它正常发育,这样得到的小鼠胚胎中,理论上就有一半细胞经历过基因编辑,另一半则没有经历过过。
这时候,左二伟博士直接将发育长大的小鼠胚胎取出来,用一些特殊的酶消化成一大堆分散的细胞。利用一些方法,我们可以追踪当时那两个细胞的后代,从这一堆细胞中将它们俩各自的后代分成两拨。由于这两拨细胞也是之前的细胞分裂而来,所以它们的基因就相当于是最初那个细胞的复制品。
这也顺便解决了第三个问题,裂解掉这一大堆足以构建出半个小鼠胚胎的巨量细胞,一次性就能提取到足够测序分析的DNA,从而避免了体外扩增带来的噪音。
在神经所蒲慕明所长的建议下,研究团队将这套系统命名为GOTI。可以说,这套系统的推出,标志着人们终于得以用数字来衡量基因编辑的脱靶率。
GOTI的技术流程:在二细胞期向一个卵裂球注射基因编辑工具,并用CRE使之本身以及后代细胞都发出红色荧光。等小鼠胚胎发育到14.5天后取出母体,利用流式细胞仪将两个卵裂球的后代分开,并各自全部消化掉提取DNA来做测序分析。
哪种基因编辑易脱靶?我们挨个测一下
终于到了检测工具一显身手的时候。它接下来要帮助人们回答的关键问题就是:那些常见的基因编辑工具真的会脱靶吗?在GOTI的神威下,一切清晰了起来。
首先,值得庆幸的是,最经典的spCas9系统经受住了考验。结果显示,它引起异常基因突变的可能性不高于小鼠自身细胞分裂带来的本底基因突变。就是说,从目前的检测结果来看它是安全的。
CRISPR-Cas9系统已经成为目前最方便的基因编辑工具。图片来源:origene.com
与此同时最令人大跌眼镜的发现是,另一类叫做单碱基突变系统(Base Editor)的基因编辑工具有着异常高的脱靶率。所谓的单碱基突变系统,大致上可以理解为我们先设计一个只能精确靶向但不会切割DNA的Cas9蛋白,然后让这个Cas9蛋白牵着一个能够通过化学方法将某个碱基定向突变(比如A→T)的酶来给DNA链中引入点突变。
原本这套系统因为不会引入DNA断裂,被视为特别安全的一类基因编辑技术,人们从来不觉得它会脱靶,之前的脱靶检测也完全没有发现它有任何脱靶的迹象。因此以刘如谦(David Liu)等为代表的一群科学家长期都在致力于将这项技术作为基因编辑向临床进军的急先锋。
通过检测发现,经典的CRISPR/Cas9并没有显著的脱靶现象,但是单碱基编辑系统BE3则出现了高出背景基因突变水平数倍的脱靶现象。
这时候研究团队才突然意识到,就算Cas9没有在sgRNA带领下跟任何DNA序列结合,那个能够引起碱基定向改变的酶也依旧存在,它完全可以像任何在细胞里游离的酶一样,让任何偶然接触自己的碱基发生化学反应。这样的系统天然就有高脱靶率的,可能之前大家对“没有DNA链断裂就没有脱靶”形成了思维定势,才会忽视这一安全漏洞。
长久以来,因为缺少令所有人都信服的脱靶检测技术,基因编辑的脱靶问题被吵吵嚷嚷了五年多,也让这个领域在此期间一直处于野蛮生长的状态。
图片来源:图虫创意
如今,GOTI出现了,规则还会远吗?(编辑:Yuki)
参考文献:
Zuo, E.#, Sun, Y.#, Wu, W.#, Yuan, T.#, Ying, W., Sun, H., Yuan, L., Steinmetz, L., Li, Y.*, Yang, H.*(2019)Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos. Science Online
Schaefer, K. A., Wu, W. H., Colgan, D. F., Tsang, S. H., Bassuk, A. G., & Mahajan, V. B. (2017). Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo. Nature methods, 14(6), 547-548.
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