作品为两个混声合唱团而写，(女高音，女中音，男高音，男低音)和乐器组(2支长笛或是 八孔长笛，2支巴洛克双簧管，2把巴洛克小提琴，中提琴，低音提琴)负责演出。现在则称为“双合唱团和管弦乐队”

在第 1 和 35段还要有Soprano in ripieno（合奏女高音）。演出传统上还会有儿童合唱团(作为两个合唱团中女声的对照)，这还和巴赫当时的情况有关，当时在教堂只能动用童声女高音，(就是说男性假声唱女高音和女中音)。在其中一个版本中，这部分的声音甚至为管风琴所代替。受难曲描述耶稣被钉在十字架受难的宗教音乐，马太受难曲则是以圣经“马太福音”第26,27章为歌词的大型作品，共有“最后的晚餐”、“耶稣之死”共 68 首曲子所组成，总共写了三年之久。而演出时须有二个管弦乐团、数位演唱者与一个少年合唱团，加上管风琴伴奏，演奏全曲需要约三小时。

马太受难曲有以下独唱角色:

福音传教士 – 男高音

耶稣 – 男低音

加略人犹大 – 男低音

圣彼得 – 男低音

祭司长该亚法 – 男低音

本丢彼拉多 – 男低音

2 侍女 – 女高音

2 教士 – 男低音

彼拉多之妻 – 女高音

两位目击者 – 女中音和男高音

作品的特殊编制来自于首演地点圣托马斯大教堂位于圣坛两侧的两架管风琴与诗班席，两个合唱团和管弦乐队产生出非常特殊的音响效果，两个合唱团会进行对话，扮演不同的角色，或是唱出作为省思的评论。值得一提的是开头和结尾两个大合唱。作品中有大量的长而深沉的咏叹调，表现了耶稣的受难。全曲共分六段剧情，以五首圣咏（Chorale）分隔。其中采用哈斯勒（Hans Leo Hassler, 1564–1612）于 1604 年所写的德国情歌旋律，由巴赫加上和声的圣咏 O Haupt voll Blut und Wunden，被称为“受难圣咏”（Passion Chorale），以不同的调性与歌词一共出现五次，是全曲的核心。这五首圣咏分别是

No. 15：Erkenne mich, mein Hüter

No. 17：Ich will hier bei dir stehen

No. 44：Befiehl du deine Wege

No. 54：O Haupt voll Blut und Wunden

No. 62：Wenn ich einmal soll scheiden

受难圣咏不但出现在圣难曲中，巴赫亦在其他作品当中使用，包括“圣诞神剧”也有使用到受难圣咏。

在马太受难曲中，巴赫使用了许多音乐象征手法。例如耶稣的宣叙调有弦乐伴奏，被称为“光环”。而其他人则只有低音提琴伴奏。在耶稣被钉上十字架之后的最后一句话 - 大喊“Eli, Eli, lama asabthani?”（我的神，我的神， 为什么离弃我？）时，是全曲当中耶稣角色唯一没有光环的段落（No. 61a）

有很多研究试图找出曲中数字命理学意义，但现在认为，其中的一部分现象只是偶然巧合。根据巴赫学者 Joshua Rifkin 于 1975 年发表于 The Musical Quarterly 的“The Chronology of Bach's Saint Matthew Passion”，马太受难曲应首演于 1727 年的受难日（Good Friday，1727/4/11），地点在圣汤马斯大教堂（St. Thomas Church），第二次演出是两年后的 1729 年的受难日（1729/4/25）。巴赫曾对马太受难曲做过几次改版，目前可听到的演出是以 1736 年的修订版为主。

巴赫在生时，马太受难曲并不受欢迎，甚至因为其中“歌剧般”的特质受到新教虔信主义的代表和莱比锡的市民敌视。当1829年3月11日门德尔松和柏林歌唱学院再度演出该作品时，巴赫也在德国复活了。20世纪诞生了很多伟大的马太受难曲录音，如富特文格勒，卡尔·李希特，卡拉扬，哈农考特，索尔蒂，汤·考普曼，赫尔穆特·李陵，加德纳都有留下非常优秀的诠释。